ESOSOMI DA CELLULE STAMINALI NELLA SLA E SM (VIDEO) Dr Prof. Bruno Bonetti - Viva La Vita Italia

ESOSOMI DA CELLULE STAMINALI NELLA SLA E SM (VIDEO) Dr Prof. Bruno Bonetti

Le cellule staminali rappresentano una tipologia di cellule indifferenziate presenti in tutte le fasi della vita e all’interno di  tutti i tessuti. La funzione attribuitagli è di far crescere l’organismo in ogni sua fase. Il ruolo principale è mantenere l’equilibrio tra cellule viventi e cellule morte intervenendo proprio nel rimpiazzo di queste ultime. Le stesse hanno come principale caratteristica quella di sapersi differenziare in cellule appartenenti a varie tipologie cellulari. Praticamente hanno la capacità di tramutarsi in cellule di qualsiasi tessuto organico.

Proprio quest’ultima caratteristica genera grande interesse all’interno del mondo scientifico soprattutto nel settore della medicina rigenerativa la quale propone di utilizzarle per rimpiazzare le cellule danneggiate in varie patologie a carico del SNC (sistema nervoso centrale) e SNP (sistema nervoso periferico).

L’utilizzo delle stesse non avviene nelle stesse modalità. Innanzitutto è necessario classificare le patologia neurologiche in base alla sede del danno. In pratica, è necessario riconoscere se il danno è concentrato in una ben delimitata area “Focale” come nel caso dello Stroke e del Parkinson. In questo caso è possibile iniettare le cellule staminali direttamente nella zona interessata dal danno quindi in loco. Nel caso contrario come nella SLA  dove il danno è “diffuso”, si agisce attraverso somministrazione sistemica ovvero attraverso somministrazioni E.V./flebo.

Oggi è possibile affermare che tra le cellule staminali mesenchimali di origine adiposa e quelle di origine midollare osseo non si notano grandi differenze. Entrambi riescono a modificare positivamente il percorso della patologia sia nella SLA ma soprattutto nella SM.

I risultati ottenuti utilizzando la prima categoria di staminali sui murini hanno reso risultati talmente promettenti da indurre la comunità scientifica ad avviare un primo trial clinico internazionale a doppio cieco avente la SM come patologia in esame. (Primo assoluto nella SM. In questo trial le staminali sono autologhe e la somministrazione è unica. L’obiettivo non è curare ma verificare se l’iniezione ha una certa efficacia sulla patologia.  Se i risultati del trial verranno considerati accettabili, tale metodica verrà estesa in maniera continuativa anche ad altre patologie. In caso contrario, il trial verrò chiuso già dalla prima fase. Al momento vi sono 6 pazienti in trattamento a Verona.

Un importante quesito a cui i ricercatori cercavano di dare una risposta era se le cellule iniettate riuscissero a migrare in modo efficiente e prendere diretto contatto con i neuroni in degenerazione. A tal proposito, ci si rendeva conto che fosse maggiormente probabile la presenza di un meccanismo paracrino alla base del processo. E che fosse  proprio quest’ultimo a rendere possibile la modulazione del percorso patologico del tessuto interessato.

Analizzando questo meccanismo paracrino si è giunti a confermare la grande importanza dei fattori rilasciati dalla cellula stessa una volta raggiunta la sede interessata dal danno. Ad oggi possiamo affermare che è proprio grazie all’azione di queste particelle subcellulari che si riusciva ad modulare l’evolversi del percorso patologico dell’intera zona danneggiata. Tra i fattori solubili riconosciuti tra i responsabili del meccanismo di comunicazione tra cellula-cellula vi sono alcune vescicole extra-cellulari tra le quali suscitano grande interesse gli esosomi.

Gli esosomi rappresentano delle vescicole piccolissime sotto i 100 nm. Esse sono rilasciate da tutte le cellule in particolar modo dalle cellule staminali e grazie alle loro proprietà riescono a raggiungere qualsiasi tessuto in maniera random con una loro maggiore concentrazione laddove ve ne sia più bisogno. Si tratta ci composti subcellulari totalmente sicuri, addirittura più sicure delle staminali in quanto sfortunatamente sono stati documentati episodi di decesso del murino a seguito dell’inoculazione di queste ultime.

Per ottenere una popolazione pura di esosomi si procede partendo da una cultura di cellule staminali. Una volta sviluppate, si preleva parte dell’liquido in cui crescono ed è proprio da quest’ultimo che si estraggono gli esosomi. Al momento del prelievo la popolazione non risulta ancora omogenea, perciò si passa ad un processo di selezione attraverso una purificazione, una ultra-centrifugazione 100.000g ed infine un ulteriore filtrazione che garantisce una popolazione unicamente composta da esosomi.

Una volta confermata l’utilità delle cellule staminali si voleva verificare se la loro principale funzione era da adibire agli esosomi. A tale scopo si è deciso iniettare unicamente esosomi e verificare i risultati ottenuti utilizzando il medesimo modello patologico, in questo caso il modello EAS.

Nel grafico seguente possiamo osservare i risultati così ottenuti. I Pallini in nero rappresentano la popolazione di COTROLLO ovvero i murini non trattati con esosomi, quindi registrano il percorso della patologia senza interferenze. Quelli bianchi dimostrano l’andamento della malattia nei murini trattati con esosomi. Per via EV. E’ possibile notare un miglioramento del 50% c.a. nella gravità della malattia. (Un Successo).

Praticamente si è riusciti a replicare il risultato ottenuto con  la cellula staminale intera, ma  utilizzando unicamente gli esosomi. Di seguito è riportiamo un confronto con  un grafico che dimostri l’efficacia delle staminali intere all’interno dello stesso modello patologico.

Possiamo affermare senza alcun dubbio che i grafici risultano sovrapponibili e che l’efficacia risulta pressoché identica.

Studiando il cervello e il midollo spinale dei murini è stato osservato concretamente come l’utilizzo degli esosomi abbia influenzato positivamente l’evolversi della patologia. Difatti la demielinizzazione e l’infiammazione erano nettamente inferiori nei murini trattati con esosomi rispetto alla situazione dei murini appartenenti al gruppo di controllo.  Si è arrivati ad affermare che la ragione di tali risultati è da attribuire alla caratteristica degli esosomi di ridurre la risposta immunitaria. In particolar  modo risultano in grado di ridurre la proliferazione dei linfociti e di bloccarne la penetrazione nel tessuto cerebrale impedendo danni dovuti all’azione di questi ultimi.

Oggi si suppone che nella SLA vi sia tra le cause un danno ossidativo del tessuto neurologico. Per testare e quantificare le capacità neuro-protettive degli esosomi in seguito a stress ossidativi, sono stati prelevati dei motoneuroni e messi in coltura. Lo schema seguente mostra la sopravvivenza degli stessi in seguito all’aggiunta di fattori ossidanti e non.

La barra bianca a sinistra indica le cellule vive 100%. Successivamente, nella prima fase del test è stata aggiunta dell’acqua ossigenata (H2O2). Come risultato si è avuto la morte di tutta la linea cellulare. Nella seconda fase è stato ripetuto il medesimo test ma come variante oltre all’H2O2 vi sono stati aggiunti esosomi. Il risultato ottenuto dimostra una capacita neuro-protettiva degli esosomi tanto elevata da permettere al 50% della linea cellulare di sopravvivere.

Il medesimo esame è stato ripetuto nel modello SLA sui murini con la mutazione del gene SOD1(G93A). La patologia in questo modello (Controllo) esordisce verso il giorno 80-85, peggiora e porta alla morte il murino verso il giorno 120-130.

Nel gruppo di murini in trattamento invece, l’inizio della terapia si èfatta coincidere con  l’inizio dei sintomi. Si è provveduto a somministrare esosomi di origine adiposa per via EV ogni 4 giorni sino alla morte. Sono stati così ottenuti i seguenti risultati.

I risultati si dimostrano molto incoraggianti. In pratica i topi trattati con esosomi hanno mostrato migliorie nelle performance motorie e un aumento della sopravvivenza del 10-15%, sopravvivendo oltre i 150gg.  Il grafico seguente mostra il confronto dell’andamento della patologia nei soggetti di controllo e in quelli trattati. E’ possibile notare una fase di quasi sovrapponibilità protratta sino al 90gg. Da questo punto in poi i percorsi divergono favorendo nettamente la popolazione trattata con esosomi.

Altri quesiti a cui si è cercato di dare risposta è:

  1. “Qual è la destinazione degli esosomi successivamente all’inoculazione?
  2. Dove agiscono?
  3. Fin dove sono in grado di arrivare?”

Per rispondere a tali domandi sono state utilizzate delle nano particelle magnetiche “ delle nano biglie di ferro” (USPIO) come strumento di ricerca degli esosomi all’interno dell’organismo.

In pratica sono state aggiunte le USPIO all’interno dello stesso terreno di coltura dal quale verranno estratti gli esosomi. Questi ultimi durante la loro formazione e il loro nutrimento, le inglobano senza ricevere alcun danno.

Nell’immagine seguente è possibile visualizzare le USPIO all’interno degli esosomi.  “i piccoli puntini neri”

Possiamo notare l’abissale differenza di dimensioni fra i due elementi.

 Successivamente alla loro inoculazione, è stato possibile monitorarne la posizione attraverso l’utilizzo della RM sensibile alle nano-particelle magnetiche “contenute al loro interno”. Grazie a questa metodica è possibile monitorarne la migrazione evitando il sacrificio del murino.

Nell’immagine seguente è possibile visualizzare una popolazione di esosomi all’interno delle zampette.

Nel modello della sclerosi multipla è stata notata la migrazione e la concentrazione degli  esosomi all’interno dei linfonodi.  Le zone blu all’interno dell’immagine ci confermano indirettamente la presenza e l’azione degli esosomi in alcune zone dei linfonodi.   La loro visualizzazione è possibile grazie alla presenza delle USPIO presenti all’ interno e che grazie ad alcune metodiche vengono evidenziati in blu.

In questi mesi è stato verificato in contemporaneamente se l’azione degli esosomi si estendeva anche alla rigenerazione o alla sostituzione delle zone morte del cervello. Si ipotizzava eventuali capacità rigenerative a favore di neuroni, astrociti  e di cellule ormai “morte”. Sfortunatamente i risultati sono stati alquanto negativi. Sono stati comunque riscontrati casi di rigenerazione dei tessuti morti ma tale casistica abbracciava unicamente l’1% dei casi. Sfortunatamente l’1% è un fenomeno biologicamente irrilevante e ne consegue una momentanea inefficienza almeno su questo aspetto.

Oggi possiamo essere soddisfatti degli attuali risultati ottenuti. In vista di una futura applicazione terapeutica a base di esosomi possiamo considerarli abbastanza promettenti. L’obiettivo finale di tale metodica è quella di ottenere un effetto immunosoppressore e neuro-protettivo almeno nei modelli della SLA e della SM.

1 Simposio Viva La Vita Italia – 7 Maggio 2016, Foggia

a cura di:

dr. Pasquale Pio Clemente

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